2018年11月29日，汪方炜实验室在The Journal of Biological Chemistry杂志在线发表题为“A positive feedback mechanism ensures proper assembly of the functional inner centromere during mitosis in human cells”的研究论文，揭示了有丝分裂期着丝粒组装的正反馈调控机制。
染色体的正确分离依赖于姐妹染色体粘连（sister chromatid cohesion）以及动粒（kinetochore）与纺锤体微管（spindle microtubule）连接的动态调控。作为染色体上高度特化的重要功能区，着丝粒（centromere）不仅是动粒组装的基础，也是有丝分裂期姐妹染色体粘连的主要部位。通过招募数十种蛋白，着丝粒的内层（inner centromere）在调节姐妹染色体粘连和动粒-微管的连接中发挥重要作用。内层着丝粒结构和功能的缺陷会造成染色体错误分离，进而导致染色体的不稳定性。而染色体不稳定性不仅是癌细胞的常见特征，还能促进肿瘤的发生和发展（Bakhoum F et al., Nature, 2018）。但是，调控内层着丝粒组装的具体分子机制尚不清楚。
Shugoshin（日语中意为“守护神”）是染色体稳定性的重要保护者。在体细胞中利用RNA干扰技术敲减Shugoshin家族Shugoshin-1（简称Sgo1）蛋白的表达会导致姐妹染色体粘连的丧失和着丝粒结构的严重破坏，这给Sgo1调控着丝粒组装的机理研究造成了很大的困难。博士生梁材利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，结合单链寡脱氧核糖核苷酸（single-stranded DNA oligonucleotides/ssODN）作为DNA损伤后同源定向修复的供体模板，在一株染色体相对比较稳定的人宫颈癌HeLa细胞中实现了对Sgo1基因的精准突变，即将Sgo1蛋白第492位赖氨酸残基突变为丙氨酸（简称K492A）。带有K492A突变的Sgo1失去对第120位苏氨酸磷酸化的组蛋白H2A（H2ApT120）的结合能力，并且不能像野生型Sgo1那样定位于染色体的着丝粒区。博士生张振蕾利用活细胞显微成像技术实时追踪并比较了野生型和Sgo1-K492A突变体细胞在有丝分裂期的命运，发现突变体细胞中染色体错误分离的比例明显增加（即染色体不稳定性）。而且，突变体细胞的增殖偏慢，并表现出对低浓度化疗药物紫杉醇（paclitaxel）的敏感性。
利用荧光显微技术对有丝分裂期染色体的观察发现，Sgo1-K492A突变体细胞的内层着丝粒有明显的缺陷，主要表现为该区域姐妹染色体粘连变弱和染色体乘客复合体（chromosomal passenger complex/CPC；动粒-微管连接的重要调节者）富集程度的下降。接着，梁材同学通过表达Sgo1与着丝粒结构蛋白CENP-B的融合体，将多种不同类型的外源Sgo1突变体人为地定位至突变体细胞的着丝粒区，进而分析内层着丝粒结构和功能缺陷的修复情况。实验结果显示，Sgo1与蛋白磷酸酶PP2A的结合不仅对于姐妹着丝粒粘连是重要的，而且能促进CPC在着丝粒的定位。进一步的机理研究表明，Sgo1通过结合PP2A保护了着丝粒区的黏连蛋白复合体（cohesin；姐妹染色体粘连的介导者），cohesin则通过其Pds5B亚基结合蛋白激酶Haspin，进而，Haspin一方面通过拮抗Wapl（cohesin的破坏者）增强姐妹着丝粒的粘连，另一方面通过磷酸化组蛋白H3促进CPC在着丝粒区的富集。
基于这一系列实验结果，并结合国外同行关于cohesin可以结合Sgo1的重要发现（Liu H et al., Nat Cell Biol 2013, Curr Biol 2013, Mol Cell 2015; Hara K et al., Nat Struct Mol Biol 2014），论文构建了由Sgo1-cohesin-Haspin构成正反馈调控回路的工作模型（如图所示），阐述了该回路调控内层着丝粒组装的分子机制，并提出了将着丝粒区cohesin的富集程度关联于癌细胞染色体不稳定性的设想。
图释：Sgo1-cohesin-Haspin正反馈回路调控有丝分裂期着丝粒组装的分子机制。
博士生梁材和张振蕾是论文的共同第一作者，陈亲富等其他同学也有重要贡献，汪方炜教授为通讯作者。汪方炜实验室的研究由国家重点研发计划（2017YFA0503600）、国家优秀青年基金（31322032）及国家基金面上项目（31771499、31571393、31371359）、NSFC-RS中英人才基金（31561130155）、英国皇家学会牛顿高级学者基金（NA140075）、浙江省自然科学基金杰青和重点项目（Z19C070003、LR13C070001）、中央高校基本科研业务费专项资金以及浙江大学自主科研计划校长专项等资助。
原文链接：http://www.jbc.org/content/early/2018/11/29/jbc.RA118.006046.abstract
