2016年7月25日，我院朱永群实验室在Nature Structural & Molecular Biology期刊上在线发表题为“Structural Basis for Cas3 Inhibition by the Bacteriophage Protein AcrF3”的研究论文，揭示噬菌体蛋白AcrF3抑制病原菌I型CRISPR-Cas免疫系统效应分子Cas3的分子机理。

AcrF3-PaCas3复合物晶体结构示意图

        病原菌中广泛拥有CRISPR-Cas免疫系统，用于抵抗来自病毒（噬菌体）或者质粒等外源核酸类物质的入侵。其中I型CRISPR-Cas免疫系统在细菌中存在最为广泛，其功能主要是由crRNA介导沉默复合物Cascade和DNA降解效应分子Cas3来完成的。Cascade复合物利用其结合的crRNA分子，特异地识别目标DNA，在目标DNA上形成特殊的R-loop结构，并招募下游效应分子Cas3到R-loop上。由于Cas3同时具有核酸酶活性和DNA解旋酶活性，I型CRISPR-Cas系统利用Cas3将目标DNA双链解开并加以降解。在长期的细菌与噬菌体相互斗争和生物共进化过程中，噬菌体也进化出了独特的蛋白分子，拮抗细菌宿主CRISPR-Cas免疫系统，从而促进自身的生存。其中噬菌体JBD5的AcrF3蛋白能够特异地作用于绿脓杆菌的Cas3效应分子（简称PaCas3），抑制绿脓杆菌的I-F亚型CRISPR-Cas免疫系统。然而，AcrF3这种独特的anti-CRISPR活性的具体分子机制完全不清楚。
        在这项研究中，朱永群实验室建立了PaCas3体外核酸酶酶学实验体系，发现PaCas3具有很好的多种二价金属离子依赖的核酸酶活性。进一步的生化实验揭示AcrF3蛋白在溶液状态下形成同源二聚体分子，以高亲和力的方式与PaCas3特异地结合，有效地抑制了PaCas3体外核酸酶活性。通过解析2.6埃高分辨率的PaCas3-AcrF3复合物的晶体结构，该研究发现PaCas3由一个独立的N端Cas2结构域、HD型核酸酶结构域、SF2型解旋酶结构域（由RecA1和RecA2两个亚结构域组成）、Long Linker区以及C端结构域（CTD）所构成。单独的Cas2蛋白被报道在CRISPR-Cas免疫系统的DNA adaptation（DNA适应）过程中发挥关键作用，Cas2与Cas1形成摩尔比2：4的整合酶复合物，将获取的外源DNA插入CRISPR基因座中。PaCas3拥有独立的Cas2结构域，说明PaCas3不同于以往报道的Cas3分子，它同时参与了CRISPR-Cas系统中的DNA适应和DNA干扰两个过程。
        在PaCas3-AcrF3复合物晶体结构中，AcrF3以同源二聚体的方式与PaCas3的紧密结合，这与我们的生化实验结果完全一致。单个AcrF3分子呈现由六股α-螺旋组成的双层结构，并通过疏水相互作用、以反向对称的方式形成同源二聚体分子。破坏二聚体中两个分子之间的疏水作用，将导致AcrF3完全丧失了抑制PaCas3体外核酸酶活性的能力。在复合物结构中，AcrF3二聚体结合在PaCas3 的位于Long Linker区与CTD结构域之间的凹槽区域，并与PaCas3的HD、Long Linker区、RecA2和CTD结构域之间发生了广泛的相互作用。其中，AcrF3与RecA2之间的相互作用完全封闭了PaCas3解旋酶结构域中DNA结合通道的入口，说明AcrF3的结合导致PaCas3不能接触由Cascade呈递来的目标DNA。令人惊讶的是，在复合物结构中，PaCas3解旋酶结构域结合了一个ADP分子，而不是通常活性解旋酶结合的ATP分子，表明AcrF3将PaCas3锁定在非活性的状态。通过进一步的结构分析，该研究还发现AcrF3也阻止了Cascade复合物的Cse1亚基对PaCas3的识别作用，导致Cascade不能招募PaCas3。因此，AcrF3蛋白以同源二聚体为活性单元，通过屏蔽PaCas3对目标DNA的接触、阻断Cascade复合物Cse1亚基对PaCas3的招募作用以及将PaCas3锁定在ADP结合的非活性状态，从而抑制I型CRISPR-Cas免疫系统，发挥其anti-CRISPR活性。
        这项研究在国际上首次从生化和原子水平揭示了噬菌体蛋白抑制病原菌CRISPR-Cas免疫系统的作用机制，首次报道CRISPR-Cas系统效应分子与anti-CRISPR蛋白复合物的三维结构，首次向人们展示了I-F型CRISPR-Cas系统效应分子Cas3的全新结构特点，对人们了解病原菌与噬菌体相互作用以及细菌CRISPR-Cas免疫系统分子机制具有重要意义。
　　朱永群实验室博士生王小飞完成该研究的所有实验工作，包括蛋白生化、酶学实验、蛋白结晶、晶体相位解析、结构初始模型搭建等，是本文的第一作者；晶体衍射数据收集在国家蛋白质科学中心（上海）BL18U1线站完成，上海光源BL17U1线站为本项研究中的原子光谱扫描提供了机时，国家蛋白质科学中心的姚德强博士在衍射数据收集和初始模型搭建方面给予了王小飞同学很多帮助，为本文的共同第一作者；其他参与的作者包括实验室成员徐锦根、李阿荣、许建坡和傅盼翰；朱永群教授为本文的通讯作者；实验室助理研究员周艳博士为本文的共同通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金委员会、浙江省自然科学基金委员会和英国皇家学会的经费资助。

        文章链接：http://www.nature.com/nsmb/journal/vaop/ncurrent/full/nsmb.3269.html